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磁珠法血液DNA提取的经典问题解答

作者: 发布时间:2017-12-14 浏览次数:1066
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       随着磁珠法核酸提取技术的不断普及,越来越多的实验室会进行磁珠法DNA提取,在使用的初期阶段,也会遇到各种各样的问题,近期就有许多老师和我们讨论如何利用磁珠进行血液DNA提取,我们对其中的常见问题进行了总结,供大家参考。

1、全血上样量与裂解体系

       全血上样量是磁珠法血液DNA提取的经典问题,无论用什么方法,首先要解决的就是上样量问题,不同的上样量对应不同的试剂体系,上样量过多或多少都会影响裂解的效果。以GNT-B02的磁珠法血液DNA提取试剂盒为例,标准上样量为200ul,上下浮动不超过100ul,搭配的裂解液用量为300-400ul,有些老师由于实验要求,需要大体积的上样量,这在实际操作中,就需要对磁珠法血液DNA提取的操作流程进行改良,一般的改良思路是按比例放大裂解体系;但有些实验的上样量达到毫升以上,这种情况下,就不能再简单的放大裂解体系了,需要先用红细胞裂解液对样品进行处理,将上样体积浓缩后,再进行血液DNA提取的操作流程优化。

2、磁珠结团

       磁珠结团是在磁珠法血液DNA提取过程中经常遇到的现象,是由磁珠本身特性和磁珠所处试剂环境两方面造成的,有些磁珠不仅在血液DNA提取过程中会结团,在其他的样本提取中也同样会结团,有些老师在初次遇到这种现象的时候会感觉不适应,其实结团现象可以用来提前预判实验结果,结团往往是吸附了大量核酸,如果哪次实验没有结团,本次的实验结果或许会不太好,不过也不能一概而论,杂质太多也是引起磁珠结团的原因。

       通过修改试剂配方,优化试剂配置,可以改善磁珠法血液DNA提取过程中的结团现象,但是该工作较为复杂,需要对各种参数进行调整。但是对于磁吸速度较慢的磁珠,结团后能明显提高磁吸速度,提高实验效率,只要磁珠在洗脱步骤能够分散,而且结果也在标准范围内,磁珠结团并不会影响整体效果。

3、得率低

       得率是影响下游实验的***直接因素,根据我们的经验,200ul的全血,得率一般在3ug以上,用GNT-B02的磁珠法血液DNA提取试剂盒,能稳定在5ug以上,有些老师的实验结果只有2ug左右,甚至更低,这就需要重点排查两个环节,一是裂解环节,二是洗脱环节,若是裂解环节的问题,往往会是在结合的时候磁珠不结团,或在洗涤的时候上清液颜色为深黄色或红色,这种情况下,更换全新的裂解液,并且严格按照SOP操作是较为效率的解决办法。

       洗脱环节的问题,经常表现为结团的磁珠未被打散,可考虑加大震荡力度,或用吸头吹吸、搅拌。有些老师在得率较低的时候,喜欢加大上样量,这可能会适得其反:过大的上样量会抑制裂解液的裂解能力。

4、纯度低

       纯度是判断实验结果的重要因素之一,一般表现为A260/A280和A260/A230,简单来讲,A260是核酸的吸光值,A280是蛋白的吸光值,A230是杂质(主要是盐类)的吸光值,对于血液DNA的磁珠法提取结果,A260/A280要在1。7-2。0之间,低于1。7存在蛋白污染,高于2。0存在RNA污染;无论高或低,主要是裂解的影响,需对裂解环节进行优化;A260/A230一般要求大于1。5,***好是能大于1。8或2。0,若A260/A230小于1。5,则认为存在污染,首先考虑盐类的污染,需对洗涤环节进行优化,其次考虑醇类的污染,需对晾干时间进行优化,有些提取结果的A260/A230异常的高,能达到十几甚至几十,这样的现象并不能很准确的分析是由什么原因造成的,需要通过下游实验进行验证。诚然,对于常规的PCR来讲,对纯度的要求并不高,甚至纯度不达标时,通过优化PCR体系,也可以实现PCR的顺利进行,但对于一些要求的较高的下游实验,纯度就是很重要的参考,需要在标准范围内才能顺利进行。

       ***后,大家有什么其他疑问,欢迎随时咨询洛阳吉恩特生物,共同交流、进步。

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